Cette page correspond à l’analyse des résultats du SNP calling effectué avec mon petit programme phruscle (“phred + muscle”).
Pour rappel, ce programme utilisait phred sur les fichiers de séquençage pour déterminer les bases. Les séquences obtenues étaient ensuite alignées à un alignement de référence composé de la séquence sauvage et de la séquence du gène synthétique.
J’ai ensuite analysé les sorties de phred qui recense la qualité des bases appelées. J’ai pu ainsi attribuer un score de qualité à toutes les bases non chimériques, ie avec une correspondance dans l’alignement de référence et dans le fichier de séquençage.
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(readr)
library(viridis)
library(cowplot)
#
fte_theme <- function() {
## Generate the colors for the chart procedurally with RColorBrewer
palette <- RColorBrewer::brewer.pal("Greys", n=9)
color.background = palette[2]
color.grid.major = palette[3]
color.axis.text = palette[6]
color.axis.title = palette[7]
color.title = palette[9]
## Begin construction of chart
theme_bw(base_size=9) +
## Set the entire chart region to a light gray color
theme(
## panel.background=element_rect(fill=color.background, color=color.background),
panel.background=element_blank(),
plot.background=element_rect(fill=color.background, color=color.background),
## panel.border=element_rect(color=color.background),
panel.border=element_rect(size = 1, color=color.grid.major),
panel.grid.major=element_line(color=color.grid.major,size=.25, linetype = "dotted"),
panel.grid.minor=element_blank(),
axis.ticks=element_blank(),
strip.text.y = element_text(angle = 0, size = 8),
## Format the legend, but hide by default
legend.position="none",
legend.background = element_rect(fill = scales::alpha(color.background, 0.3)),
legend.text = element_text(size=9,color=color.axis.title),
## Set title and axis labels, and format these and tick marks
plot.title=element_text(color=color.title, size=14,
face = "bold", vjust=1.25, hjust = 0),
axis.text.x=element_text(size=7,color=color.axis.text),
axis.text.y=element_text(size=7,color=color.axis.text),
axis.title.x=element_text(size=8, color=color.axis.title, vjust=0, hjust = 0.9),
axis.title.y=element_text(size=8, color=color.axis.title, vjust = 0.9, angle = 0 ),
## Plot margins
plot.margin = unit(c(0.35, 0.2, 0.3, 0.35), "cm")
)
}
#
theme_set(theme_bw() + fte_theme())
#
legend_position <- function(x=NULL, y=NULL) {
custom_legend <-
theme(legend.margin = unit(-0.3,"lines"),
legend.key = element_rect(fill = scales::alpha("gray", 0),
colour = scales::alpha("gray", 0)))
if (is.null(x) & is.null(y)) custom_legend + theme(legend.position = "bottom")
else custom_legend + theme(legend.position = c(x, y))
}
#
#
data_location <- "../../data/phruscle_snpcall.csv"
#
snp <- read_csv(data_location) %>%
mutate(
name = gsub("-1073.+$", "", name),
base = toupper(base)#,
)
#
find_mutant <- function(name) {
if (grepl("ws", name)) "ws"
else if (grepl("sw", name)) "sw"
else if (grepl("W", name )) "w"
else if (grepl("S", name )) "s"
else ""
}
#
# neat little trick to reduce time of rowwise application of find_mutant.
snp <- snp %>%
group_by(name) %>%
summarise(count = n()) %>%
rowwise() %>%
mutate(mutant=find_mutant(name)) %>%
inner_join(snp, .)J’ai donc obtenu un tableau de donnée de la forme suivante, où :
cons: un code maison pour déterminer le consensus. . si les trois bases sont identiques, x si la base séquencée est la base introduite, X si la base séquencée est la base sauvage, N si c’est encore autre chose.name: le nom expérimental de la séquencerefb: la base de référencerefp: la position sur la référence.seqb: le reverse complement de la base séquencée.seqp: la position sur la séquence expérimentale.snpb: la base sur le gène synthétique introduit.base: la base séquenceé.qual: sa qualité.phase: la position sur le spectrogramme.mutant: ordinal, la manip.head(snp)## Source: local data frame [6 x 12]
##
## cons name refb refp seqb seqp snpb base qual phase count mutant
## (chr) (chr) (chr) (int) (chr) (int) (chr) (chr) (int) (int) (int) (chr)
## 1 . pws1 C 47 C 1 C C 11 215 773 ws
## 2 . pws1 C 48 C 2 C C 14 228 773 ws
## 3 . pws1 T 49 T 3 T T 18 243 773 ws
## 4 . pws1 G 50 G 4 G G 10 258 773 ws
## 5 . pws1 A 51 A 5 A A 9 279 773 ws
## 6 . pws1 A 52 A 6 A A 9 287 773 ws
n_distinct(snp$name)## [1] 382
On a donc bien toutes nos séquences.
snp %>%
group_by(mutant) %>%
summarise(count = n()) %>%
knitr::kable(align = "c")| mutant | count |
|---|---|
| s | 64904 |
| sw | 72509 |
| w | 69927 |
| ws | 74074 |
snp %>%
group_by(mutant, name) %>%
summarise(count = n()) %>%
ggplot(data = ., aes(x = count )) +
geom_histogram(binwidth = 1) +
labs(x = "Nombre de positions", y = "",
title = "Distribution du nombre\nde positions par séquence")J’ai voulu déterminer s’il existe des bases dans les sorties de phruscle qui ne correspondent pas aux sorties de phd. Autrement dit si la base base est bien toujours la même que la base seqb.
FALSE %in% (snp$base == snp$seqb)## [1] FALSE
Plutôt bon signe ! Phruscle a fonctionné comme il faut, ie toutes les bases qu’on a sorties dans nos alignements ont une correspondance dans le fichier phred !.
On regarde globalement la distribution de la qualité des bases :
snp %>%
ggplot(data = ., aes(x = qual )) +
geom_histogram(binwidth = 1)J’ai regardé séquence par séquence les variation de qualité le long de la séquence :
snp %>%
ggplot(data = ., aes(x = refp, y = qual, color = qual )) +
geom_point(alpha = 0.1, size = 0.1) +
geom_line(aes(group = name), alpha = 0.1, size = 0.1 ) +
scale_color_viridis()
Position des bases de qualité < 30
snp %>%
filter(qual < 30) %>%
ggplot(data = ., aes(x = refp, y = qual )) +
geom_point(alpha = 0.1, size = 0.1)Comme attendu, la qualité est moindre en fin de run, et plutôt bonne au début1 On séquence de droite à gauche, la cassette de résistance est à la position avant -1. Ce sont des séquences trimmées par phd. On n’est pas obligé de trimmer. Peut-être refaire les analyses avec les séquences non trimmées.
snp %>%
group_by(name, mutant) %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp)) %>%
ggplot(data = ., aes(x = len )) +
geom_histogram(binwidth = 1) +
facet_grid(mutant ~ .)
snp %>%
filter(cons == "x" | cons == "X") %>%
## filter(refp < 750 & refp > 40) %>%
ggplot(aes(x = refp)) +
geom_histogram(binwidth = 1)Une fonction pour faire un alignement des positions d’intérêt, sans avoir à répéter le code deux fois pour sw et ws. J’ai hardcodé les limites de la référence basées sur le graphique dans la marge.
find_polarity <- function(reference, experimental) {
is_w <- function(base) { ifelse(base == "A" | base == "T", TRUE, FALSE)}
is_s <- function(base) { ifelse(base == "C" | base == "G", TRUE, FALSE)}
if (is_w(reference) & is_w(experimental)) "ww"
else if (is_w(reference) & is_s(experimental)) "ws"
else if (is_s(reference) & is_w(experimental)) "sw"
else if (is_s(reference) & is_s(experimental)) "ss"
else ""
}
plot_align <- function(data, mutant_) {
sort_by_tract_length <- function(mut) {
data %>%
filter(mutant == mut) %>%
group_by(name, mutant) %>%
filter(cons == "x") %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp)) %>%
ungroup() %>%
arrange(len) %>%
{.$name}
}
## print(sort_by_tract_length(mutant_) %>% length())
data %>%
group_by(name, mutant) %>%
filter(#refp < 750 & refp > 57,
mutant == mutant_,
cons == "x" | cons == "X" ) %>%
rowwise() %>%
mutate(sens = find_polarity(refb, seqb)) %>%
ggplot(aes(x = factor(refp),
y = factor(name, levels = sort_by_tract_length(mut=mutant_)))) +
geom_point(aes(color = sens, size = qual, alpha=qual)) +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
## scale_color_viridis( discrete = TRUE, end=0.95 ) +
scale_alpha( range=c(1/5, 0.8), guide=FALSE ) +
scale_size(range = c(1, 3), breaks = c(10, 50),
labels = c("10", "50")) +
labs(x = "Position sur la référence", y = "", color = "Remplacement",
size = "Qualité",
title = paste("Alignement pour la manip", toupper(mutant_))) +
theme(legend.position = "top",
legend.margin = unit(-0.3,"lines"),
legend.key = element_rect(fill = scales::alpha("gray", 0),
colour = scales::alpha("gray", 0)),
panel.grid.major.y = element_line(size = 0.1, linetype = "dotted"))
}
plot_qual <- function(data, mutant_) {
data %>%
filter(mutant == mutant_) %>%
ggplot(aes(x = refp, y = qual)) +
geom_point(size = 0.1, alpha = 1/20) +
scale_color_viridis(end = 0.95) +
labs(x = "Position sur la référence",
y = "") +
## coord_cartesian(xlim = c(50, 730)) +
geom_smooth(se = FALSE, color = "red", linetype = "dotted")
}
plot_align_qual <- function(data, mutant_) {
plot_grid(
data %>% plot_align(mutant_),
data %>% plot_qual(mutant_),
ncol = 1, rel_heights = c(8.5, 1.5),
align = 'v', labels = c(" 1", " 2")
)
}
n_distinct(snp %>% filter(mutant == "ws") %>% group_by(name) %>% .$name )## [1] 96
snp %>% plot_align_qual("ws")
snp %>% plot_align_qual("sw")
snp %>% plot_align_qual("s")
snp %>% plot_align_qual("w")
plot_grid(
snp %>% plot_align_qual("s"),
snp %>% plot_align_qual("w"),
snp %>% plot_align_qual("ws"),
snp %>% plot_align_qual("sw"),
labels = c("A", "B", "C", "D"), ncol = 4
)
## interactive only
## save_as_a3("test.pdf")On peut s’attendre sous l’hypothèse gBGC à ce que les traces de conversions soient plus longues lorsqu’on transforme par un plasmide porteur de S que lorsqu’on transforme par un plasmide porteur de W.
snp %>%
filter(cons == "x") %>%
group_by(name, mutant) %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp) ) %>%
ggplot(aes(x = factor(mutant, levels = c("s", "w", "sw", "ws")),
y = len)) +
geom_point(alpha = 0.2) +
stat_summary(fun.y = "mean", geom = "point", color = "red", shape = "|",
size = 7) +
labs(x = "mutant", y = "Longueur\ndu tract") +
coord_flip()snp %>%
filter(cons == "x") %>%
group_by(name, mutant) %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp) ) %>%
group_by(mutant) %>%
summarise(mean_len = mean(len))## Source: local data frame [4 x 2]
##
## mutant mean_len
## (chr) (dbl)
## 1 s 411.1648
## 2 sw 317.8750
## 3 w 388.9362
## 4 ws 386.7356
snp %>%
filter(cons == "x") %>%
group_by(name, mutant) %>%
summarise(len = max(refp) - min(refp) ) %>%
ggplot(data = ., aes(x = len, fill = mutant )) +
geom_histogram(binwidth = 5, position = "dodge") +
facet_grid(mutant ~ .) +
scale_fill_viridis(discrete = TRUE) +
labs(x = "Longueur de trace de conversion",
y = "",
title = "Distribution des\nlongueurs de trace de conversion")Pour l’instant on ne voit quand même pas grand chose de flagrant. Il semblerait même que les plasmides S introduisent des traces de conversion plus courtes, même si rien de quantifié pour l’instant.
Comptage des alternances SNP SS et WW
Pour la manip WS et SW, le but est de compter les positions où on voit des alternances de WWW ou SSS. La fonction suivante renvoit un tbl_df avec le nom, le type de mutant, le genotype. @param data: le jeu de donnée snp, @param mutant: crée un filtre par mutant. Selon les mutants, on ne recherche pas les mêmes séquences.
make_genotype <- function(data, mutant_, qual_ = 30) {
weak_or_strong <- function(base) {
is_w <- function(base) { ifelse(base == "A" | base == "T", TRUE, FALSE)}
is_s <- function(base) { ifelse(base == "C" | base == "G", TRUE, FALSE)}
if (is_w(base)) "W"
else if (is_s(base)) "S"
else if (base == "N") "N"
else stop(base, " is not a DNA base")
}
data %>%
filter(cons == "x" | cons == "X", name != "psw21", qual > qual_) %>%
filter(mutant %in% mutant_) %>%
rowwise() %>%
mutate(geno = weak_or_strong(seqb)) %>%
ungroup() %>% group_by(name, mutant) %>%
summarise(geno = toString(geno) %>% gsub(", ", "", .))
}La fonction suivante permet de compter le nombre d’anomalies, autrement dit de SNP inattendus dans les traces de conversion. Renvoit une tbl_df @param data : le jeu de donné snp @param kmer : le kmer à recenser dans le génotype.
count_kmer <- function(data, kmer) {
count_anomaly <- function(string, kmer_) {
find_xxx <- function(string) {
function(kmer_) {
XxX <- gregexpr(kmer_, string) %>% unlist()
xXx <- gregexpr(kmer_, string) %>% unlist()
counter <- 0
if (XxX[1] > 0) counter <- counter + length(XxX)
else if (xXx[1] > 0) counter <- counter + length(xXx)
counter
}
}
find_xxx(string)(kmer_)
}
data %>%
rowwise() %>%
mutate(anom = count_anomaly(geno, kmer)) %>%
filter(anom > 0)
}Si on compte le nombre de positions WWW, on en a 3 dans la manip sw :
snp %>% make_genotype(c("ws", "sw")) %>% count_kmer("WWW") %>% knitr::kable()| name | mutant | geno | anom |
|---|---|---|---|
| psw10 | sw | WSWSWSWSWSSWWWSWSWS | 1 |
| psw43 | sw | WSWSWSWWWWSWSWSWSWSWS | 1 |
| psw50 | sw | WSWSWSWSWSWSWSWSWSWWW | 1 |
Si on compte le nombre de marqueurs SSS, on en a 9 sur les deux manips :
snp %>% make_genotype(c("ws", "sw")) %>% count_kmer("SSS") %>% knitr::kable()| name | mutant | geno | anom |
|---|---|---|---|
| psw20 | sw | SSSWSWSWSWSWSWSWSWSS | 1 |
| psw3 | sw | WSWSWSWSWSWSWSWSWSSSW | 1 |
| pws24 | ws | WSWSWSWSWSWSWSWSWSSS | 1 |
| pws26 | ws | WSWSWSWSWSWSWSWSWSSS | 1 |
| pws34 | ws | SWSWSWSSSWSWSWSWSWS | 1 |
| pws38 | ws | WSWSWSWSWSWSWSWSSS | 1 |
| pws55 | ws | WSWSWSWSWSWSSSWSSSS | 2 |
| pws58 | ws | WSWSWSWSWSWSWSSWSWSSS | 1 |
Les mêmes comptages pour les manips précédentes confirment ce qu’on savait déjà :
snp %>% make_genotype("w" ) %>% count_kmer("WSW") %>% knitr::kable()| name | mutant | geno | anom |
|---|---|---|---|
| pW11 | w | SWSWWWWWWWWWWWWWWWWWW | 1 |
| pW34 | w | WWWWWWWWWWWWWWSWWWWW | 1 |
| pW48 | w | SSSSSSSSSSSWWWWWWSWW | 1 |
| pW86 | w | SSSSSSSSWWWWWSWWWWWWW | 1 |
snp %>% make_genotype("s" ) %>% count_kmer("WSW")## Source: local data frame [0 x 4]
## Groups: <by row>
##
## Variables not shown: name (chr), mutant (chr), geno (chr), anom (dbl)
# peanuts.Les mêmes comptages sans filtrer sur la qualité, on retrouve les 6 positions que Laurent voyait déjà sur les alignements:
snp %>% make_genotype("w", qual_ = 0) %>% count_kmer("WSW") %>% knitr::kable()| name | mutant | geno | anom |
|---|---|---|---|
| pW11 | w | SSWSWWWWWWWWWWWWWWWWWWW | 1 |
| pW34 | w | WWWWWWWWWWWWWWSWWWWWWW | 1 |
| pW48 | w | SSSSSSSSSSSSWWWWWWSWWWW | 1 |
| pW69 | w | SSWSSWSSSSWWSWWSWWWWWWW | 2 |
| pW85 | w | SSWWWWWWWWWWWWWWWWWWWSW | 1 |
| pW86 | w | SSSSSSSSSWWWWWSWWWWWWWW | 1 |
snp %>% make_genotype("s", qual_ = 0) %>% count_kmer("SWS") %>% knitr::kable()| name | mutant | geno | anom |
|---|---|---|---|
| pS96 | s | WWWWWWWSSSSSSSSSSSSWSS | 1 |
Franck se disait qu’il serait peut-être judicieux de comparer globalement le taux de GC global de nos séquences, sachant qu’on introduit des SNPs AT et GC dans toutes nos séquences, en tout cas pour la manip SW / WS.
get_gc_content <- function(data, mut=NULL, tidy = TRUE) {
clean_seq <- function(x) toString(x) %>% gsub(", ", "", . )
get_gc_rate <- function(dna_seq) {
}
if (is.null(mut)) mut <- c("ws", "sw", "w", "s")
gc_content <- data %>% filter(mutant %in% mut) %>% group_by(name, mutant) %>%
summarise(exp = seqinr::GC(seqb),
snp = seqinr::GC(snpb),
ref = seqinr::GC(refb))
if (tidy) gc_content %>% tidyr::gather("type", "GC", 3:5)
else gc_content
}
get_marker_only <- function(data, snp_only = TRUE) {
## permet de ne conserver que les marqueurs dans le jeu de donnée
snp_without_N <- data %>% filter(cons != "N", cons != "-", name != "psw21")
if (snp_only) filter(snp_without_N, cons == "X" | cons == "x")
else snp_without_N
}
set_mutant_factor <- function(data) {
## attribue les bons niveaux de facteurs aux donneurs s.
mutate(data, mutant = factor(mutant, levels = c("s", "w", "sw", "ws")))
}
set_seq_factor <- function(data) {
## attribue les bons niveaux de facteurs aux différentes séquences. Choisies
## de façon à ce que la base expérimentale apparaisse en rouge.
mutate(data, seq = factor(seq, levels = c("seqb", "refb", "snpb"),
labels = c("Expérimental", "Référence", "Donneur")))
}
set_base_factor <- function(data) {
## attribue les bons niveaux de facteurs aux différentes bases, de façon à ce
## que S et W clusterent.
mutate(data, base = factor(base, levels = c("G", "C", "T", "A")))
}
snp %>%
get_gc_content() %>%
filter(name != "psw21") %>%
mutate(mutant = factor(mutant, levels = c("s", "w", "sw", "ws"))) %>%
group_by(mutant, type) %>%
## summarise(gc_mean = mean(GC)) %>%
ggplot(
aes(y = GC,
x = factor(type, levels = c("snp", "exp", "ref"),
labels = c("Donneur", "Expérimental", "Receveur")))) +
geom_jitter(aes(color = mutant), width = 1/3, alpha = 0.5) +
stat_summary(fun.y = mean, geom = "point", color = "black", shape = "¦",
size = 6) +
facet_grid(mutant ~ .) +
labs(y = "% GC", x = "") +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
coord_flip()snp %>%
get_gc_content() %>%
set_mutant_factor() %>%
filter(name != "psw21") %>%
mutate(type = factor(type, levels = c("ref", "exp", "snp"),
labels = c("Receveur", "Expérimental", "Donneur"))) %>%
ggplot(aes(x = type, y = GC, color = mutant)) +
## geom_point() +
geom_line(aes(group = name), alpha = 0.3) +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
labs(x = "", y = "%GC", color = "Donneur :") +
legend_position()snp %>%
set_mutant_factor() %>%
get_marker_only(TRUE) %>%
select(name, mutant, refp, seqb, refb, snpb) %>%
tidyr::gather(key = seq, "base", 4:6) %>%
group_by(mutant, seq, base) %>%
summarise(count = n()) %>%
ungroup() %>%
set_seq_factor() %>%
set_base_factor() %>%
ggplot(aes(x = base, y = count, color = seq, shape = mutant )) +
geom_point() +
facet_grid(mutant ~ .) +
scale_shape_discrete(guide = FALSE) +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
labs(y = "", x = "", shape = "Séquence :", color = "Donneur :") +
coord_flip() +
legend_position()